背景介绍印迹和主要母系表达细胞周期抑制剂基因CDKN1C位于染色体11p15.5，编码负生长调节剂也称为P57KIP2。该基因与两种相反的表型相关：过度生长症Beckwith-Wiedemann综合征（BWS,[MIM：]）和生长受限的IMAGe综合征（[MIM：]）。IMAGe和罕见的Silver-Russell综合征（SRS）病例是由CDKN1C的PCNA结合模序中的功能获得（GoF）突变引起的，而在8％的BWS患者中发现了功能丧失（LoF）突变。CDKN1C是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDI），属于CIP/Kip家族，其他成员是p21Cip1（CDKN1A）和p27Kip1（CDKN1B），它们抑制G1中的细胞生长并可能导致细胞周期停滞。ENSEMBL数据库（ensembl.org）包含几个编码不同同工型的CDKN1C转录本。CDKN1C-编码aa同种型A，CDKN1C-编码具有不同UTR的替代同种型A，CDKN1C-编码具有替代起始位点的aa异构体B，CDKN1C-编码aaA6NK88异构体，我们称之为同工型D。CDKN1C具有一个N末端CDI（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂）结构域，一个中央PAPA（脯氨酸丙氨酸）重复序列和一个C末端PCNA（增殖细胞核抗原）结合模序和一个重叠的推定的含KRKR的核定位信号。BWS通常是由母体11号染色体上的印记中心2（IC2）偶发性甲基化（LoM）导致的，导致CDKN1C表达减少，大约在BWS的50-60％中发现，其次约20％是父系节段性单亲二体（UPD）11p也涉及IGF2-H19域的父本甲基化印迹中心1（IC1）。5-10％的患者报道了IC1甲基化（GoM），而IC1和CDKN1C的微缺失变异是家族性BWS的重要原因。其他染色体CNV、平衡重排、多位点印迹障碍等是BWS的罕见原因。其典型特征是眼眶疝/脐疝、大舌症、新生儿胰岛素过多症、Wilms瘤、过度生长、巨鼻、耳朵折痕、肾上腺胎儿皮质的细胞增生和肾脏异常等。基因型与表型的相关性据报道为CDKN1C突变相关的早产、腭裂、腹壁缺损、毛细血管畸形等，而宫内过度生长和肿瘤则较少见。母体遗传的GoF变异可引起IMAGe综合征（一种SRS样表型）、矮身材以及糖尿病，但此类变异是生长受限的罕见原因。IMAGe于年首次被描述与CDKN1C相关。此外，两名11p15孕妇重复的患者描述了由于肾上腺功能不全而类似IMAGe导致的SRS表型。迄今为止，仅报道了12个分子确证的IMAGe/SRS样家族，除意义未明变异（VUS）以外的所有变异，其他都位于PCNA结合位点。大多数研究表明，IMAGe/SRS变异可提高蛋白质稳定性。该机制尚未完全阐明，但可能包括蛋白酶体介导的降解受损。临床表现包括身材矮小、新生儿肾上腺皮质发育不全、高钙尿症、骨骺端发育异常、骨龄延迟、耳位低和后旋、额头凸起和相对大头畸形以及听力减退。目前尚无关于IMAGe综合征的共识标准，CDKN1C尚未与人类的神经系统表型相关联，但据报道，少数BWS患有结构性脑异常的患者发育迟缓。此外，IMAGe和BWS的混合症状之前尚无报道。在此，我们报道一个携带CDKN1C基因杂合插入缺失（dellins）变异的男孩，基因缺陷导致了混合的IMAGe和类似BWS的特征，并且还可能导致发育延迟。我们的目标是确定这种复杂的变异如何同时具有GoF和LoF效应，并为受影响的脑功能找到潜在的解释。我们的工作表明，带有非典型C末端阅读框的新CDKN1C转录物编码同工型A6NK88（我们将其命名为同工型D）也受到了这种delins的影响，并且由于同工型D也表达在大脑中，这可能是由于他发育迟缓的原因。结果1．患者的临床病史患者在妊娠第19周通过常规超声检查发现脐带膨出，进行了羊膜穿刺术，并在妊娠的第29周开始并发产妇呕吐、先兆子痫、糖尿病以及羊水过少并发妊娠。他在妊娠第34+2周剖腹产后出生，出生体重g（-1.1SD）、身长42cm（-2.5SD）、头围32cm（0SD）。在1、5和10分钟后，Apgar得分分别为3/5/7。他患有轻度低血糖症（1.5mmol/L）、呼吸困难。巨大的食管膨出区还包含肝脏组织，他接受了几次手术，直到3个月大时腹壁才被关闭。需要CPAP，直到5个月大才出院。在头5个月内，他完全由鼻胃管喂养，并在12个月后将其取出。3岁那年，他经历了20多次手术，他具有多种畸形特征，包括动脉导管未闭、腹股沟疝、隐睾症和轻度肌张力低下。在25个月大时进行随访时，他的身长为0.8SDS，体重为-2.0SDS，现在是小头畸形的（-2.7SDS）。生长里程碑推迟，15个月时可以坐，在2岁零10个月大的情况下可以无须支撑而步行。在3岁时，他会说几个简单的单词，在5岁时，他有3-4个单词的句子中有发音问题。他的神经系统检查，听力、视力和社会发展正常。他接受了语言、教育和物理治疗。从4个月大开始反复进行腹部超声检查，双侧肾脏小、无器官增大。在2.5岁时，ACTH刺激测试并未显示出肾上腺功能不全。5岁时，他的身高为-1.5SDS，头围百分率不变，证实了出生后/继发性小头畸形（-2.5SDS），而他的BMI仍然很低，为12.9（-2.8SDS）。他计划每六个月进行一次癌症监测，直到7-8岁。2．家族史患病男孩的父母表型正常、非近亲。母亲的临床检查和出生史均为BWS特征阴性。祖父出生时体重5公斤，新生儿时粗大的舌头被评论，暗示巨舌症。在58岁时的检查，身高厘米、嘴巴大，没有不对称现象，骨骼X线检查正常，认知能力正常。3．诊断检查在怀孕期间，在羊水细胞中发现了正常的男性核型46，XY。出生后，为证实对患病男孩BWS的临床怀疑，对BWS区域进行MS-MLPA检测，发现血液、皮肤和表皮痣的DNA中是正常的。随后，对CDKN1C进行测序以验证BWS。由于身材矮小、发育迟缓和出生后的小头畸形，我们对其进行了进一步分析，高分辨率CNV分析、UPD筛查和trio-WES等方法均得出了正常结果。4．CDKN1C变异的解读CDKN1C的Sanger测序（NM_.2/ENST.7）显示，在编码影响外显子2的5-端的PCNA结合基序的序列中，存在杂合的delins变体，即c._delinsGAGCTG。所述delins引起移码和外显子2-3连接上游约个核苷酸的过早终止密码子（PTC）。这种变化应导致无义介导的mRNA衰变（NMD）或截短蛋白AspGlufsTer12的合成，即符合BWS表型的LoF变化。但是，除了共有的AG位点之外，该delins还引入了两个新的假定的剪接连接AG受体位点。使用替代受体位点I也将导致移码和新的终止密码子，但在最后一个蛋白质编码外显子中，即AspGlufsTer47，它应逃脱NMD。相应的蛋白质产物包含一个修饰的C末端，包括四个IMAGe相关氨基酸的取代，并引入了已知的GoF变体PheSer。替代受体位点II的使用符合蛋白质C末端部分的规范阅读框架，但也包括PCNA结合模序_delinsAlaVal中的三个缺失和两个新氨基酸的插入。这将修饰一个IMAGe残基（AspAla），但还会引入以前报道的IMAGe相关取代：PheVal。将该替代转录本与已知的IMAGe变异的转录本进行比较，可能提高蛋白质的稳定性或影响PCNA的结合。通过BLAST分析了p.AspGlufsTer47预测的框外C末端产物，发现其与CDKN1C-几乎相同，编码个氨基酸的同工型我们将其称为同工型D（UniProtKB登录号A6NK88）。同工型D由具有唯一C端D尾的公共CDI域组成，其替代剪接绕过了PAPA重复区域。除了与PCNA相关的氨基酸取代外，通过引入移码将阅读框变回标准阅读框。预测的杂合蛋白具有来自两个不同同工型D和A/B的元素，其中D型剪接导致CDI结构域与改变的PCNA结合模序直接连接，而delins诱导的移码导致C末端为属于A/B类型而非D类型。5．患者家庭的诊断分析患病男孩的无症状母亲也携带该delins杂合变异，遗传自她父亲，并且进一步的家庭研究（包括单倍型分离分析）证实了该变异是新发自祖父的母体等位基因上。祖父的轻度BWS特征表明有嵌合性，这已通过对多个组织的DNA分析得到证实。四分之三的皮肤活检组织和成纤维细胞中仅存在野生型基因，而在血液、尿液沉积物和皮肤活检组织中则发现了该delins变异。cDNASanger测序和qPCRcDNA测序证实了男孩、他的母亲和祖父中存在野生型和较低水平的delins等位基因，基因表达水平普遍较低。然而，测序表明，来自所有家庭成员和对照的血液中均存在野生型同工型D（CDKN1C-）转录本，而来自男孩的血液中存在delins-CDKN1C-转录本。半定量实时PCR（qPCR）验证了来自患者、父母和祖父的血液样本中CDKN1C（异构体A/B）和CDKN1C-（异构体D）转录本的存在。此外，在所有家族成员的成纤维细胞中都发现了同工型A/B。与B2M对照相比，转录本水平较低，成纤维细胞中的转录水平明显低于血液中的水平。在男孩和祖父的血液中发现了delins-CDKN1C的表达，但在母亲的血液中却未见，而男孩的成纤维细胞表达却很低，而其他人则无法检测到。没有显示cDNA测序和qPCR的结果。6．基于NGS的cDNA测序进行超深RNA测序，可对所有转录本（包括delins变异）进行更定量的无偏分析。分析证实男孩中的delins变异水平为40-50％（成纤维细胞高于血液），嵌合携带的祖父为25％，母亲中为6％。标准和超深度RNA测序均无法验证预测的第五个转录物CDKN1C-的存在（ENST.1）编码假定的aa蛋白产物，标记为同工型C（CCDS.1）。过滤后，所有RNA-seq样本的读数总计3.4亿，并且跨越剪接点（SJT）的CDKN1C轨道数在35至之间。我们创建了三个新的FASTA参考文件，其中包含用于精确映射的delins，一个基于共有剪接位点，两个基于其他受体位点I和II。转录本CDKN1C-、CDKN1C-、CDKN1C-（组合）和CDKN1C-对参考序列的映射结果，并将分布与其他CDKN1C转录本的总和进行了比较。在IGV中以弧线形式显示，绝大多数表达的转录本均来自不同长度的5-UTR，包括CDKN1C-和CDKN1C-，并且都在下游使用替代的Met11氨基酸并具有四个外显子。相反，CDKN1C-和CDKN1C-始终始于Met1，并具有三个外显子。CDKN1C-使用最后一个外显子下游5个核苷酸的替代受体剪接位点，可与其他转录本区分开。CDKN1C-的编码部分继续进入第4外显子，而该外显子正在其他转录本中形成3-UTR。讨论该家族由于CDKN1C中存在相同的delins变体，而在先证者中混合了完全相反的与生长相关的综合症，说明该基因的生物学复杂性远远超出了印迹。由于错位错综复杂的基因剪接，这种蛋白在某些同工型上具有LoF效应，而在另一种异构体上具有GoF效应。后者对于5个核苷酸与6个核苷酸的交换是意料之外的，并且是由于在经典AG下游两个核苷酸处产生了一个新的剪接受体位点。此外，我们证明了具有不同C末端阅读框的替代同工型（我们称为同工型D，对应于转录本CDKN1C-）也受到影响，这会将同工型D的C端变回同工型A/B阅读框。如果在大脑中表达了混合的D-A/B同工型转录物，则可能是其发育迟缓的原因。无症状的携带者母亲表达delins变异较低。与中间表达水平相一致，外祖父在他的母亲等位基因上表达了嵌合的变异。需要注意的是，转录本的相对水平不能表示由于可变和不良表达而引起的印迹程度，也可能受NMD不一致和不均匀的影响。据报道，具有相同PTC的mRNA中的NMD效率以及逃逸的mRNA亚群的NMD效率存在差异，这有助于解释个体之间以及不同组织之间的变异。事实证明，超深RNA测序优于常规RNA分析，尤其是在成纤维细胞RNA上。这种无偏测序验证了替代受体位点I的使用，使我们能够量化不同转录本的表达，并表明了哪些异构体最丰富。总体而言，患病男孩符合BWS的临床标准-一种过度生长的状况-尽管其体格较小且微头畸形，总分为8分，但具有两个主要特征（食道膨出和大舌症）。BWS中常见巨人症或新生儿过度生长，但被认为是提示性而非主要特征。对于IMAGe，尚无临床共识，但他的许多非BWS功能与该诊断重叠。在IMAGe和BWS中都描述了生殖器异常，但仅在IMAGe中描述了小睾丸。即使未在IMAGe中讨论肾脏大小（仅胎儿肾皮质大小），但他的肾脏发育不全很可能是BWS中肾脏增生的IMAGe镜像。骨骼异常是IMAGe中的重要发现，但不对称性在SRS中不太重要，而且不是BWS的特征。临床上，他没有通过Netchine-HarbinsonSRS评分，具有3/6的标准，低于4/6的极限。他的胎龄小、进食困难、轻度骨骼异常和睾丸小与IMAGe兼容。临床发现表明CDKN1C中LoF（BWS）和GoF（IMAGe）都具有双重分子作用。后者可以通过来自替代受体位点II的p.Asp_delinsAlaVal编码转录本来解释，但是我们无法确认该转录本在两个受试组织中的表达。另一个假设的GoF候选对象是来自替代受体位点I的p.AspGlufsTer47编码转录本，具有经过验证的GoF替代PheSer。该转录物编码消除PCNA结合位点的另一个C末端，但该产物也可能是无功能的或降解的。NMD作为CDKN1C的保护机制可能是无效的，因为共有剪接位点的截短转录本（即编码p.AspGlufsTer12）完全存在于NMD的理论标准之内，同时存在于血液和成纤维细胞中。该突变体产物还替代了IMAGe相关氨基酸，也可能具有GoF效应。CDKN1C早期没有报道由于同一基因中的单个突变而导致的相反表型的组合，但是对于另一个印迹基因GNAS来说，这并不是什么新鲜事。据报道，其他基因会同时引起GoF和LoF影响的基因是RET、FLNA、GDF5和SMCHD1。一般而言，多核苷酸变体比单核苷酸变体的破坏力可能更大，正如我们的家庭所说明的那样。与野生型CDKN1C-相比，delins突变的CDKN1C-使用经典的阅读框，产生了一种混合的D-A/B产品，这可能是男孩异常特征的原因。也许这种调节的复杂性是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的独特之处。我们的研究确定CDKN1C-（异构体B）是最丰富的转录本，其次是CDKN1C-（异构体D）。GTEx门户网站（gtexporal.org）建议CDKN1C-是最丰富的同工型，尤其是在大脑中，其次是CDKN1C-和CDKN1C-编码的同工型，但这可以解释为PAPA-CDKN1C-中未包含的重复区域。CDKN1C-仅在人类和一些高等灵长类动物中报道。尽管胚胎脑中CDKN1C的表达较高，但是尽管有些患者有脑异常的报道，但发育迟缓和小头畸形并未被认为是BWS或IMAGe的特征。但是，发现BWS的行为和情感障碍以及自闭症谱系障碍比对照组更常见，尤其是在患有IC2缺陷的患者中。此外，在癌症易感综合症诊所中，一半的BWS或单纯性偏肥大患者需要特殊治疗。delins突变的D-A/B转录本是对孩子发育迟缓的最好解释。由新生儿低血糖症或未经治疗的肾上腺疾病引起的脑损伤极不可能，而且他的脑部MRI正常，但早产和长期住院可能是造成这种情况的因素。与其他IMAGe患者进行比较非常困难，因为许多患者尚未得到分子证实，并且可能包括像MIRAGE综合征这样的表型。高分辨率CNV分析和trio-WES均未揭示其发育迟缓的其他解释，但是在进一步的类似病例证实与CDKN1C-的神经系统相关之前，不能排除其他解释。总而言之，我们的研究结果表明，单一的delins变异可通过不同的分子病理机制产生三种不同的表型。迄今为止尚未报道的转录本CDKN1C-，也编码具有丰富脑表达的同种型D（A6NK88），也受到该变体的影响。需要进一步的功能研究或其他患者来研究同工型D在大脑发育中的作用，并验证该同工型的变化是否可能导致CDKN1C谱的第三张面孔：发育延迟。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
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